如何检测艾滋病

2009-12-24 13:39来源:百度百科
如何检测艾滋病:艾滋病检测-概述 是指采用实验室方法对人体血液、其他体液、组织器官、血液衍生物等进行艾滋病病毒、艾滋病病毒抗体及相关免疫指标检测 艾滋病主要的检测方法有以下几种: (一)抗体检测 主要有酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫荧光试验(IFA)。ELISA
  艾滋病检测-概述
  
是指采用实验室方法对人体血液、其他体液、组织器官、血液衍生物等进行艾滋病病毒、艾滋病病毒抗体及相关免疫指标检测
  艾滋病主要的检测方法有以下几种:
  (一)抗体检测
  主要有酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫荧光试验(IFA)。ELISA用去污剂裂解HIV或感染细胞液提取物作抗原,IFA用感染细胞涂片作抗原进行抗体检测,如果发现阳性标本应重复一次。为防止假阳性,可做Westernblot(WB,蛋白印迹法)进一步确证。
  WB法是用聚丙烯酰胺凝胶电泳将HIV蛋白进行分离,再经传移电泳将不同蛋白条带转移于硝酸纤维膜上,加入病人血清孵育后,用抗人球蛋白酶标抗体染色,就能测出针对不同结构蛋白抗体,如抗gp120、gp41、P24抗体,特异性较高。
  快速检测法,也称为金标法,也是抗体检测的一种方法,根据免疫层析法的原理,用于HIV抗体检测的定性检测。
  (二)抗原检测
  用ELISA检测P24抗原,在HIV感染早期尚未出现抗体时,血中就有该抗原存在.由于P24量太少,阳性率通常较低。现有用解离免疫复合物法或浓缩P24抗原,来提高敏感性。
  (三)核酸检测
  用PCR法检测HIV基因,具有快速、高效、敏感和特异等优点,目前该法已被应用于HIV感染早期诊断及艾滋病的研究中。
  (四)病毒分离
  常用方法为共培养法,即用正常人外周血液分离单个核细胞,加PHA刺激并培养后,加入病人单个核细胞诊断及艾滋病的研究中。
  【关键词】 获得性免疫缺陷综合征 HIV 实验室技术和方法 艾滋病(AIDS)又称获得性免疫缺陷综合征,是由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染所引起的一种免疫缺陷性疾病[1]。HIV感染的诊断是艾滋病预防控制工作的重要组成部分,建立敏感实用的检测方法对于监测、诊断或血液筛查,控制艾滋病的流行显得尤为重要。以下本文就HIV的检测技术现状及进展做一综述。
  1 HIV的感染机制及感染标志
  
 
  HIV病毒侵入人体后,其表面糖蛋白gp120与细胞表面受体蛋白CD4以高亲和力结合,吸附到宿主细胞上;gp120再与宿主细胞表面辅助受体相互作用,使病毒与宿主细胞膜更接近;gp41产生一系列构象变化,其N端的融合肽片段插入宿主细胞膜,导致病毒包膜与细胞膜的最终融合,病毒RNA进入细胞。在HIV感染后,最先能够监测到病毒RNA、然后是p24抗原,最后是抗体[2]。
  在感染后的10~14 d内,病毒RNA水平是呈指数上升,随后下降并保持在持续稳定的水平上,进入HIV无症状期[3]。p24抗原水平随着病毒RNA水平的发展而发展,在急性感染期就可以出现,被认为是病毒复制的间接标志,但由于检测方法的灵敏度不够而使得其检出时间要比RNA晚。从HIV感染到能够检测出HIV抗体这一时期,被称作“窗口期”。在窗口期,能够通过病毒RNA、p24抗原和CD4淋巴细胞水平来确定HIV感染。CD4淋巴细胞水平随着感染的发展而逐渐下降,当其在血液中细胞下降到200个/mL时,就会发生[1]严重的免疫缺陷,患者就被确诊为艾滋病。病毒RNA、p24抗原、HIV抗体和CD4淋巴细胞水平可以用来确定HIV感染、检测病情发展[4]。
  HIV在病毒分类中属逆转录病毒科慢病毒属中的人类免疫缺陷病毒组。迄今为止,根据血清学反应和病毒核酸序列测定,全球流行的HIV可分为2型:HIV?1型和HIV?2型[5]。在HIV?1型内,根据编码包膜蛋白的env基因和编码壳蛋白的gag基因序列的同源性又进一步分为3个组:M组(主要组)、O组(外围组)和N组(新组或非M非O组),M组内又可分为A?J10个亚型。在HIV?1型和HIV?2型之间,其核苷酸序列有45%的同源性,并且存在免疫交叉反应。应用免疫印迹法(West blot)可以将二者明确地区别开来[6]。
  2 HIV感染的主要检测方法
  

  目前检测HIV的方法有100多种[7],总体来说可以分为抗体检测和病毒检测两大类。病毒检测包括细胞培养(病毒分离)、p24抗原检测和病毒核酸检测。早期对HIV的诊断主要是通过血清学试验检测抗HIV的抗体,间接地诊断HIV感染。近几年,分子生物学方法不断被应用到HIV的检测中,HIV的实验室诊断方法取得了很大的进展,核酸检测已经成为了HIV实验室诊断的发展方向[8]。
  抗体通常是在感染后3~8周能够被检测出来[9]。目前,大多应用双抗原夹心法,这种方法具有很好的灵敏性和特异性。抗体检测由初筛和确认试验组成,初筛试验呈阳性的必须进行确认试验。酶联免疫吸附分析(ELISA)方法有一定的灵敏度,且操作简单、快速,适合对大量样品的检测。因此,是目前临床通用的初筛检测方法。国际上有3种确认试验方法[10],包括免疫印迹试验、条带免疫试验及免疫荧光试验,目前以免疫印迹试验最为常用。
  在窗口期,病毒抗体不能被检出,但可以检测到病毒相关抗原或分离病毒。抗原能够在个体感染后先于血清转化2~18 d被检测到。因此,在血清转化期通过检测p24抗原有着很大的优势,可以作为早期辅助诊断HIV感染的一种方法[11]。
  病毒培养是检测HIV感染最精确的方法。一般采取培养外周血单个核细胞(PBMC)的方法进行HIV的诊断[12]。
  病毒核酸检测通常是通过检测HIV RNA水平来反映病毒载量,具有很高的灵敏度,使用适时荧光聚合酶链反应(PCR)技术,能够在HIV感染的前2周检测到病毒核酸。病毒核酸检测方法可用于HIV的早期诊断,如窗口期辅助诊断、病程监控、指导治疗方案及疗效测定、预测疾病进程等。目前常用的测定方法有逆转录PCR实验(RT? PCR)、核酸序列扩增实验(NASBA)、分支DNA杂交实验(bDNA)等。使用高灵敏度的适时荧光PCR技术,能够在HIV感染的前2周检测到病毒核酸[13,14]。
  2.1 HIV抗体、抗原检测
  HIV抗体一般在人感染后几周逐渐出现,可延续至终生[15],血清学试验分为初筛和确认试验。最常用的初筛试验和确认试验分别是酶联免疫吸附试验和免疫印迹试验(WB)。常规实验方法:酶联免疫吸附试验、免疫印迹试验(WestBlot)、间接免疫荧光法(IFA)。快速检测方法:明胶颗粒凝集试验、斑点免疫结合试验、P24抗原的检测、分子生物学方法、RT?PCR检测法、荧光实时PCR检测技术、支链DNA(bDNA)、连接酶酶促链式反应(LCR)、核酸序列依赖性扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)
  2.1.1 酶联免疫吸附试验
  ELISA法的基本原理是免疫反应物通过化学或免疫学的方法形成酶结合物,酶结合物能与待检样品中相应的抗原或抗体结合成为免疫复合物,然后加入酶底物,经酶的催化或水解作用,无色底物产生颜色,用肉眼、分光光度计观察结果。初筛用的HIV ELISA试剂目前已经发展到第四代检测试剂。第一代试剂主要以病毒裂解物或部分纯化的病毒抗原包被反应板,以检测血清中的抗体。由于包被的抗原不很纯,假阳性率较高。第二代试剂使用基因工程方法得到的重组抗原和合成肽包被反应板,由于纯化抗原的使用,特异性有了很大提高。第三代试剂使用双抗原夹心法检测抗体,进一步提高了敏感性。第四代试剂则在第三代的基础上进一步增加了P24抗原的检测,把HIV抗原和抗P24的抗体同时包被反应板,可同时检测血清中的HIV抗体和P24抗原。
  2.1.2 免疫印迹试验
  免疫印迹试验主要用于确认试验,基本原理是HIV全病毒抗原经过SDS?PAGE电泳,将分子量大小不等的蛋白带分离开来,然后再把这些已经分离的不同蛋白带电转移到硝酸纤维素膜上。将此膜切割成条状,每一条硝酸纤维素膜上均含有经电泳分离过的HIV病毒抗原。将待检血清样品用稀释液稀释成1/100,再把它直接加到硝酸纤维素膜上,恒温震荡,使其充分接触反应,血清中若含有抗HIV抗体,就会与膜条上的抗原带相结合。加入抗人IgG酶结合物和底物后,即可使有反应的抗原?抗体结合带呈现紫褐色,根据出现条带情况判定结果。有报告说,免疫印迹试验的特异性不是很好, 有大约2%的假阳性率,但免疫印迹试验依然是目前最常用的HIV确认试验。
  2.1.3 免疫荧光试验(IFA)
  基本原理为应用H?9或HUT?78培养细胞作为载体,用HIV感染细胞,该细胞内就会含有HIV抗原,将HIV感染的淋巴细胞涂于玻片上,固定,制备为抗原片,加入待检血清,待检血清中的抗 HIV抗体与抗原结合后,再与荧光素标记的抗人Ig结合,在荧光显微镜下可见到细胞内有黄绿色荧光。
  2.1.4 明胶颗粒凝集试验(PA)
  PA的基本过程是先将样品稀释,然后分别加入经抗原致敏的和未致敏的明胶颗粒,混匀后保温(一般为室温)。当血清中有HIV抗体存在时,经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原抗体反应,根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。PA操作简便,无需特殊仪器设备,适合对少量标本的检测。
  2.1.5 斑点印迹试验(或免疫层析/或渗滤)
  斑点印迹试验一般采用硝酸纤维素膜作固相载体, 用HIV抗原包被于固相载体,加入待测标本(可为血清、血浆、尿液和其他体液),一定温度反应后洗去未结合于固相载体上的标本,包被抗原和被检血清中抗体结合,用胶体金(或胶体硒)代替底物连接在葡萄球菌蛋白A上,金标记蛋白A具有与人Ig结合的能力,因而可与被捕获的HIV抗体结合。若样品中有HIV抗体,则薄膜上就会产生一桔红色斑点(或线条),一般3~10 min出结果,特异性较好, 较为适宜于偏远地区临床用血检测,但不适于城市地区的献血员筛查。
  2.2 分子生物学方法
  随着生物技术的发展,核酸检测得到了人们越来越多的重视,它可直接检查HIV RNA,可在发现血清学变化之前检测HIV感染,而且比P24抗原检测方法更灵敏[16]。
  2.2.1 多聚酶链反应检测法
  PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成。
  ① 模板DNA的变性:模板DNA经加热至93 ℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备。
  ② 模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55 ℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。
  ③ 引物的延伸:DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成1条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链,重复循环变性—退火—延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成1个循环需2~4 min, 2~3 h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。检测HIV?RNA,需要先利用逆转录反应将RNA转录为cDNA,继而以cDNA为模板进行PCR扩增即可,这样的反应称为RT-PCR。
  2.2.2 实时荧光定量PCR技术
  实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
  本技术的原理是使用荧光基团标记探针,5′端标记荧光基团R,3′端标记淬灭基团Q,在没有PCR扩增时,由于荧光基团和淬灭基团空间距离很近,使荧光基团被淬灭,不发荧光;而当PCR扩增时,引物与荧光标记的特异性探针同时结合在模板上,荧光标记的探针与模板的结合位置位于上下游引物之间,利用Taq酶的5′?3′外切酶活性,将荧光探针水解,荧光基团被释放出来,由于在空间上与淬灭基团分开,则发出荧光。发出的荧光可以被荧光探头检测到,一边扩增,一边检测,这样就实现了“实时”检测。该技术不仅实现了PCR从半定量到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性强、自动化程度高、有效解决了PCR污染问题等特点[17]。
  2.2.3 支链DNA检测法——bDNA
  bDNA是定量检测血浆中的HIV?1型RNA的一种方法。bDNA是指人工合成的带有侧链的DNA片段,在其每个侧链上都可以标记被激发的标记物。将HIV的RNA通过离心从病毒颗粒中释放出来,然后用捕获探针1将其捕获到微孔中。捕获探针2与病毒RNA的另一部分特异结合,又与预放大探针结合。后者再与放大探针即bDNA探针杂交。两套靶探针分别与病毒RNA的pol基因的不同区域特异结合。在微孔中形成了HIVRNA?寡核苷酸复合物。再加入1种化学发光底物孵育后可放大化学发光信号。通过发光强度来定量,因为发光强度与样品中HIVRNA含量成比例。bDNA不存在扩增物的交叉污染,这较PCR是一大进步。bDNA有数十个覆盖整个基因组的探针,可以方便地检测HIV某些变异株,但灵敏度不及PCR,提高bDNA灵敏度是一大难点[18]。
  2.2.4 核酸序列依赖性扩增法(nucleic acid sequence based amplification, NASBA)
  NASBA是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异性核苷酸序列等温扩增RNA的新技术。反应在 42 ℃进行 ,可在 2 h内将RNA模板扩增约 109倍。NASBA原理是提取病毒RNA,加入AMV逆转录酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶和引物进行扩增[15]。整个反应分非循环相和循环相:在非循环相中,引物I与模板RNA退火后在AMV逆转录酶的作用下合成cDNA,形成RNA:DNA杂合体,随即RNaseH降解RNA,引物Ⅱ与cDNA退火, 在反转录酶作用下合成第2条DNA互补链。双链DNA可在T7RNA聚合酶的作用下,经其启动子序列起动而转录RNA,RNA又可在反转录酶的作用下反转录成DNA,进入循环相,对模板进行大量扩增。
  2.2.5 转录介导的扩增技术(transcription mediated amplification, TMA)
  TMA技术原理与NASBA基本一致,略有不同之处是TMA利用的是MMLV逆转录酶及T7 RNA聚合酶两种酶,MMLV逆转录酶既有逆转录酶的活性又具有RNA酶H活性。反应在 41.5 ℃进行 ,可在 1 h内将RNA模板扩增约 109倍。
  2.2.6 连接酶酶促链式反应(LCR)
  LCR是基于靶分子依赖的寡核苷酸探针相互连接的一种探针扩增技术,是继PCR后新发展的一种较有前景的体外扩增技术。它的原理就是由2段寡核苷酸单链DNA探针与目标序列杂交,当该2段DNA探针与没有发生突变的模板褪火后,如果2探针是紧邻的,中间没有核苷酸间隔,则可在连接酶作用下连接起来,连接以后的新链又可以作为模板,引导下一周期的连接产生新的子链。若连接区段发生核苷酸的碱基突变,则连接反应不能发生,扩增反应终止。
  3 目前检测技术的不足
  细胞培养的方法检测HIV专一性强,不会出现假阳性,对于确认那些抗原/抗体检测不确定的个体和阳性母亲新生儿是否感染HIV有着重要的意义。但是须要有一定数量的感染细胞存在才能培养和分离出病毒来,因而敏感性差、操作时间长、操作复杂,必须在特定的P3实验室中才能进行,且费用较高(每次培养需要约200~500美元),不适用于临床[19]。
  p24抗原检测能够在病毒开始复制后检测到血液中的可溶性p24抗原,但易出现假阳性。因此,阳性结果必须经中和试验确认,该结果才可作为HIV感染的辅助诊断依据。HIV?1 p24抗原检测阴性,只表示在本试验中无反应,不能排除HIV感染[20]。
  病毒核酸检测方法具有很高的灵敏度,对疾病进展的监测、抗病毒疗效观察和耐药性监测非常重要。但是,由于HIV基因的多样性,没有一套引物可以覆盖所有的HIV序列,使检测的敏感性又受到限制;此外现有的病毒核酸检测方法或是检测仪器、检测试剂昂贵,或是操作复杂,对操作人员要求高,既难以在一般实验室推广,又不适用于对大量患者的快速检测,同样不适合广泛的临床应用。
  因此,既要提高检测的敏感性、特异性,缩短窗口期,又要简便、快速和降低成本已成为HIV检测技术发展的要求和方向,很多的研究正致力于寻找病毒检测的替代技术。
  4 HIV检测技术的进展
  
 
  近年来,HIV检测技术取得了很大进展。如发展了ICD p24抗原测定法(immune?complex disassociate,免疫复合物解离,ICD)、第四代HIV检测试剂、超敏感EIA、线性免疫酶测定(lineal immunoenzymatic assay)等,使检测出HIV感染的时间大大提前[21,22]。
  4.1 HIV检测试剂的发展
  从1985年第1代HIV抗体检测试剂问世到现在[23],HIV血清学检测试剂已经发展到了第4代。第4代ELISA试剂的优点在于能同时检测抗原和抗体,降低血源筛查的残余危险度。与第3代抗HIV?1/2试剂相比,检出时间提前了4~5 d,窗口期缩短了1周多,在对艾滋病早期诊断的效果上明显优于第3代。
  但使用第4代试剂对艾滋病毒进行检测,仍然有2~3周的窗口[24]。此外,由于把抗原和抗体同时包被在反应板上,存在着相互干扰的可能,影响了免疫反应的特异性。而且由于第二窗口期的存在,也使得检测的敏感性受到影响。一般来讲,使用第4代试剂检测p24抗原,其灵敏度(20~100 pg/mL)远远低于单独检测抗原抗体分析法(3.5~10 pg/mL)。从方法学上来讲,这种基于ELISA的分析方法,灵敏度终归是有限的。相对化学发光和时间分辨荧光免疫分析技术等更先进的分析方法,它的灵敏度比较低。由此可见,提高敏感性、特异性、缩短窗口期和简便快速是HIV检测试剂未来发展的主要趋势。
  4.2 病毒检测方法的发展
  4.2.1 核酸检测方法研究进展
  随着分子生物学技术的发展,核酸检测越来越受到人们的重视并将其与抗原抗体反应的高特异性结合起来形成了免疫PCR技术。这一技术具有特异性强和灵敏度高的特点,可用于单个抗原的检测。这促进了应用PCR技术进行HIV核酸检测的快速发展。自2001年起[25],COBAS Ampliscreen HIV? 1 Test等4种HIV核酸检测技术通过了FDA的批准,作为进筛选分析技术来进行HIV?1的检测。最近,实时荧光PCR检测技术的应用使HIV核酸检测技术又进入到一个新境界[26]。通过这种技术,不但可以进行定性检测,更重要的是可以进行定量检测。Barletta等将这一技术应用到HIV的检测中,大大降低了病毒载量的检测限(0.66个拷贝相当于0.33个病毒粒子)。2002年4月国家药品监督管理局(SDA)批准了第一个HIV荧光PCR检测试剂盒。
  4.2.2 p24抗原检测方法研究进展
  随着检测灵敏度不断提高, p24抗原的检测逐渐从主要用于在窗口期辅助早期诊断和进一步缩短窗口期,发展到用于病毒载量测定。目前,p24抗原在以下几方面都有重要应用:HIV?1抗体不确定或窗口期的辅助诊断;HIV?1抗体阳性母亲所生婴儿早期的辅助鉴别诊断;第4代HIV?1抗原/抗体ELISA试剂检测呈阳性反应,但HIV?1抗体确认阴性者的辅助诊断;监测病程进展和抗病毒治疗效果。但现有监测病程进展和抗病毒治疗效果均采用昂贵、操作复杂的病毒RNA测定方法。我国HIV/AIDS患者绝大部分是在基层,检测1次病毒载量需要上千元(约1 500元),很难在基层普及,对疾病的治疗和控制很不利。高灵敏度p24 抗原检测方法的建立成为在发展中国家使用的病毒载量测定方法的一种选择。
  近几年,国外对建立高灵敏度检测p24抗原的研究一直没有停止,如为了提高检测血清中p24抗原的敏感性,将血清中免疫复合物解离后再进行测定,发展了ICD p24抗原测定法。2003年Sutthent[27]等将免疫复合物热解离后通过TSA信号放大系统使用ELISA进行检测,使p24抗原检测的最小检出值由原来的10 pg/mL降低到0.5 pg/mL,在HIV?1抗体阳性母亲所生婴儿早期的诊断中与RNA检测相当,与HIV核酸检测具有可比性,具有重要的实用价值。2004年,来自HIV病毒的发现者之一美国马里兰大学Dr.Robert C.Gallo所领导的实验室的一篇高灵敏度检测p24抗原的研究论文引起了广泛的关注,p24抗原的检测成为比病毒核酸检测更灵敏的方法。2005年来自美国马里兰大学的一篇长篇综述也开始关注p24抗原的检测,认为这可以作为低成本、适合在发展中国家使用的替代现有昂贵的RNA测定方法的一种选择。
  目前,商品化的p24 抗原的标准检测方法主要是依据夹心ELISA原理。该方法是用抗p24抗原的抗体包被固相的双抗体夹心法,是检测抗原最为常用的方法,国内尚未见商品化的HIV p24抗原检测试剂的生产。综上所述,用高灵敏的分析方法诊断艾滋病将有助于实现早期诊断,避免漏检,有助于对治疗艾滋病药物的疗效评价、预测和监测疾病进程,提高检测的灵敏性、缩短窗口期,是HIV诊断方法和诊断试剂持续发展的主要方向。

  以上简述了HIV的流行概况和实验室的检测技术,相信随着HIV实验室检测技术的不断的改进,尤其是核酸检测技术的不断应用,HIV检测的窗口期将会逐步缩短,经输血传播HIV可能性也将会大大减小。

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